Robust. Stable. High productivity.

双特异性抗体（Bispecific antibody, BsAb）是一类能够同时结合两个抗原或表位的工程化抗体，同时能在靶细胞和功能分子或细胞之间架起桥梁，激发具有导向性的免疫反应，具有靶向性更强、毒性较低但研发生产技术壁垒高等特点，现已成为抗体工程领域的热点，极大地拓展了抗体药的应用领域，满足了单抗药物以及单抗药物联用无法满足的临床需求。据估计，到 2028 年，双特异性抗体治疗市场将以每年两位数的速度增长，全球双特异性抗体市场将超过 250亿美元。此外，显著的行业趋势和机遇将继续强劲推动相关市场的增长。

双抗分子的设计千秋各异，从构型上把研发人员的想象力，科学设计能力发挥到了极致，双抗分子有对称型结构，也有非对称型结构，基于scFv设计的非IgG小片段等结构，不同构型的双特异性抗体在开发过程中，会遇到不同的难点。如非对称的KiH双抗结构通常由两条不同的重链和轻链（或两条不同的重链和相同的轻链）组成，因此在组装过程中很容易出现多种由于错配而产生的杂质，而且由于这些杂质往往与我们的目标结构理化性质相似而难以被去除；而一些对称的双抗结构又由于引入了额外的构型（如scFv）经常会产生聚集或者片段等问题。因此，如何能够持续稳定的生产具有高产率和纯度的双抗分子，并考虑到未来的可放大性及商业化生产，需要我们研究人员在CMC方面拥有更为敏锐的专业知识和经验。

细胞株开发是CMC阶段的第一步，也是工艺开发的基础，细胞株开发决定了最终的产物质量。相比于单抗，双抗的细胞株开发项目工作量较大，开发时间也会相对较长。如何在细胞株表达量，产物质量以及开发时间这三个方面找到平衡点，是双抗细胞株开发过程中必须面临的挑战。康日百奥细胞株开发平台拥有完全自主开发CHO细胞表达载体，会根据双抗项目的不同结构，相对应的设计不同的载体转染方式（图1）。例如，当面对三条或者四条链的双抗分子时，我们通常会选择双载体系统来进行转染，并提前利用瞬转技术对不同的载体转染比例进行筛选，根据表达水平、SEC、CE及HIC纯度以从中筛选到表达量及正确配对比例相对最好的转染比例用于稳转细胞株开发。

图1. 双抗细胞株开发项目的载体构建策略

由于目的基因在电转后插入细胞基因组的随机性，通常需要较单抗细胞株开发进行更高通量（通常为3-4倍）的mini-pool细胞筛选并辅以多种分析手段来获得表达和正确配对率较高的候选cell pool用于单克隆筛选。基于团队成员多年的构建经验，已经优化出具有平台化的双抗细胞株开发流程，筛选基数在mini-pool和单克隆阶段分别达到300-1200个以及150-600个，对于筛选出单克隆细胞的表达量，质量和稳定性都更有保证，并降低了杂质对后续纯化工艺带来的挑战。

图2. 2021-2022年部分双抗项目表达量

康日百奥可以提供具有商业化授权的ATCC CHO-K1，Merck CHOZN-K1等清晰溯源的多平台宿主细胞，通过对关键质量属性的关注，构建稳健的细胞株开发平台，致力于为客户的生物药开发提供高质量的符合cGMP要求的细胞株建库服务。从目的序列接收到单克隆筛选完成，最快可在4个月内完成交付。并且，康日百奥的CHO-K1宿主细胞具有优秀的可放大性（图3），在不同培养规模上均能表现出高度可比的质量相似性。并且，对于交付单克隆细胞株的稳定性，康日百奥均能保证至少2株以上的细胞能够拥有超过60个世代的稳定性，不论是表达水平，蛋白质量还是基因水平稳定性。

图3. 康日百奥细胞株的可放大性

图4. 康日百奥细胞株的稳定性

康日百奥以稳健的工艺交付了包含单克隆抗体，双特异性抗体（对称+非对称）、融合蛋白等的细胞株构建项目，伴随高表达，可放大性，良好的细胞株稳定性，进入到后续CMC开发阶段，并顺利通过美国，澳大利亚，中国的临床研究申请。不仅如此，康日百奥也能在合作伙伴的Discovery阶段介入，利用CMC平台帮助进行候选分子的可开发性研究，缩短开发周期，减少项目CMC阶段开发的风险，以稳健的工艺，高效的生产将分子快速的推进临床。

双特异性抗体是治疗性抗体领域中极具创新性的一个版块，尽管这类分子的应用前景巨大，但由于存在双抗特异性的副产物（如错配，片段，高聚体等），也为这类分子的开发和生产带来了诸多挑战。因此，在这类产品开发的整个生命周期中，与拥有丰富双抗分子开发经验及专业知识的伙伴一起合作至关重要。康日百奥便是这样一位专注于克服复杂分子挑战的合作伙伴，致力于帮助客户推动创新双抗疗法的开发，为当前未满足的临床需求提供更多有效的治疗手段。